Ada tiga jenis bakteri yang dapat digunakan untuk
menunjukkan adanya masalah sanitasi, yaitu
Escherichia coli, kelompok Streptococcus
(Enterococcus) fecal, dan Clostridium perfringens (Anonim, 2002).
Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas
mikrobiologi air dalam praktikum digunakan kelompok Coliform sebagai
indikator.Kelompok Coliform mencakup bakteri yang bersifat aerobik dan
anaeorobik fakultatif, batang gram negatif dan tidak membentuk spora. Coliform
memfermentasikan laktosa dengan pembentukkan asam dan gas dalam waktu 48 jam
pada suhu 35°C (Hadioetomo, 1993).Dalam metode MPN digunakan medium cair,
berbeda dengan metode cawan yang menggunakan medium padat (Agar). Perhitungan
dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif, yaitu yang ditumbuhi oleh
mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung
positif dapat dilihat dengan timbulnya
kekeruhan atau terbentuk gas dalam tabung durham(Sutedjo, 1991).
Anonim.2002. Bakteri Indikator Keamanan Air Minum.
http://www.kompaskcm.htm. Diakses tanggal 3 April 2007.
Djide, M. Natsir. 2003. Mikrobiologi
Farmasi, Jurusan Farmasi UNHAS, Makassar.
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui
berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri
dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN),
uji penguat kp.dan uji pelengkap.Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis
merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri
koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode
perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap
sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu
indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel)
seperti yang dilakukan pada percobaan ini (Penn, 1991).
Inoculating (inokulasi) dengan jarum ose :
Ø Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke
bagian lup (ujung) sampai berpijar merah.
Ø Biarkan selama beberapa detik sampai pijar menghilang,
kemudian segera ambil tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, buka penutupnya
dengan ketiga jari tengah, manis dan kelingking sedangkan jari telunjuk dan ibu
jari memegang jarum ose.
Ø Bakar bibir tabung reaksi dengan cara memutar tabung
sehingga semua bagian bibir tabung terkena api.
Ø Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung reaksi, lalu
segera keluarkan. Usahakan ketika memasukkan jarum ose jangan sampai menyentuh
dinding tabung dan lakukan di dekat pembakar bunsen.
Ø Bakar kembali bibir tabung reaksi dan segera tutup. Ingat,
jarum ose jangan dibakar kembali karena akan membunuh bakteri yang akan
diinokulasikan.
Ø Ambil tabung reaksi lainnya yang akan diinokulasi, buka
tutupnya dengan cara yang sama dengan cara kedua dan bakar bibirnya dengan cara
yang sama dengan cara ketiga diatas.
Ø Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung tadi sebagaimana
cara keempat.
Ø Bakar bibir tabung reaksi dan tutup sebagaimana cara ketiga.
Ø Bakar kembali jarum ose sebagaimana cara kesatu.
Enterobactericeae
merupakan kelompok bakteri gram negatif berbentuk batang yang habitat alaminya
berada pada system usus manusia dan binatang.Keluarga Enterobactericeae
meliputi banyak jenis (escherichia, salmonella, shigella, enterobacter,
klebsiella, serratia, proteus, dan lainnya). Enterobactericeae bersifat
fakultatif anaerob atau aerob yang dapat memfermentasikan karbohidrat, dan
bakteri ini dapat disebut Coliform (Jawetz, Melnick, dan Adelberg’s,
2001).Golongan bakteri Coliform merupakan jasad indikator didalam air, bahan
makanan, dan sebagainya untuk kehadiran jasad berbahaya, yang mempunyai
persamaan sifat: Gram negatif berbentuk batang, tidak membentuk spora, dan
mampu memfermentasikan laktosa pada temperatur 37oC dengan membentuk
asam dan gas di dalam waktu 48 jam (suriawiria, 1996). Escherichia coli adalah
penghuni normal saluran pencernaan manusia dan hewan berdarah panas, biasanya
tidak patogenik.Anggota lain kelompok Coliform ialah Klebsiella pneumoniae,
yang tersebar luas dialam, terdapat dalam tanah, padi-padian, dan dalam saluran
pencernaan manusia dan hewan.Enterobacter aerogenes adalah sejenis
bakteri Coliform yang terdapat dalam saluran pencernaan manusia dan hewan, juga
terdapat dalam tanah dan air. Coliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai
bakteri berbentuk gram negatif, tidak membentuk spora, aerobik dan anaerobik
fakultatif yang memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam
waktu 48 jam pada suhu 35-37oC. Kelompok Coliform mempunyai beberapa
ciri yang juga dimiliki oleh anggota-anggota genus Salmonella dan Shigella,
yaitu dua genera yang mempunyai spesies-spesies enteric patogenik.
Namun, ada perbedaan biokimiawi utama yang nyata yaitu bahwa Coliform dapat
memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas, sedangkan Salmonella
dan Shigella tidak memfermentasi laktosa (Pelczar & Chan, 1988).Jadi Coliform dapat didefinisikan
sebagai golongan bakteri dengan ciri gram negatif, aerob dan anaerob
fakultatif, memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas pada
pengeraman 35-37oC selama 24-48 jam. Spesies yang termasuk golongan
Coliform antara lain Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, danKlebsiella
pneumonia.
Air Sumur Gali
Berdasarkan sumber dan klasifikasi
air, air sumur gali dapat didefenisikan sebagai air tanah dengan kemungkinan
tercemar yang sedikit dan hanya perlu didesinfeksi atau dimasak sebelum
dikonsumsi sebagai air minum.Adapun syarat umum sumur yaitu:
Ø Sumur harus mempunyai jarak minimal 10 meter untuk tanah
berpasir, minimal 15 meter untuk tanah liat, dan untuk bebatuan minimal 7,5
meter dari sumber pencemar terutama dari septik tank.
Ø Sumur harus mempunyai kedalaman minimal 4 meter.dan bibir
dengan ketinggian minimal 70 cm dari permukaan tanah.
Ø Dinding sumur harus diplester dengan kedap air sedalam
minimal 4 meter dan lantai ukuran minimal 150 cmx150 cm.
Ø Mempunyai saluran pembuangan sepanjang minimal 20 meter
(Daud.A, 2001).
MPN (Most
Probable Number) atau JPT (Jumlah Perkiraan Terdekat) suatu metode yang
digunakan untuk mengetahui jumlah perkiraan dari bakteri golongan Coliform.
Metode MPN biasa juga disebut dengan metode tabung ganda, karena menggunakan
tabung dengan jumlah/formasi tertentu yang berisi kaldu laktosa dan tabung
durham untuk memperlihatkan fermentasi terhadap laktosa serta pembentukan gas.
Pelaksanaan analisa dilakukan berdasarkan metode standar dari APHA (American
Public Health Association), yaitu untuk mengetahui jumlah bakteri Coliform
digunakan tabel Hopkins, yang lebih dikenal dengan tabel MPN atau tabel JPT.
Tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri Coliform
dalam 100 ml air (Suriawiria, 1996).
Pemeriksaan MPN
Coliform terdiri dari tiga tahap, yaitu (Depkes RI, 1991):
Ø Tes perkiraan (presumptive test)
Suatu seri media
laktosa broth (LB) ditambah dengan volume air yang bebeda jumlahnya
dalam seri desimal atau pengenceran 10X.misalnya:
5 tabung
pertama masing-masing ditambah dengan 10 ml air
5 tabung kedua
masing-masing ditambah dengan 1 ml air
5 tabung
ketiga masing-masing ditambah dengan 0,1 ml air
dieramkan pada
suhu 37oC selama 2 X 24 jam. Bakteri golongan Coliform akan
memfermentasikan media laktosa dengan petunjuk kekeruhan dan pembentukan gas
dalam tabung durham (tabung kecil) yang dipasang terbalik didalam media
laktosa.
Ø 2. Tes penegasan (Confermed test)
Disini dipakai
media BGLB (Brilliant Green Laktosa Broth) yang jumlahnya sesuai dengan
jumlah tabung media laktosa broth (LB) yang menunjukkan reaksi positif.
Dari masing-masing tabung media laktosa yang postif diambil satu ose , kemudian
diinokulasikan dalam masing-masing media BGLB yang disediakan sesuai dengan
deretannya, misalnya: dari LB 5.5.5 yang positif ada 5.4.1, kemudian
diinokulasikan pada BGLB dan dieramkan pada suhu 37oC selama 2 X 24
jam. Tabung BGLB yang positif yaitu yang menunjukkan adanya kekeruhan dan gas
pada tabung durham, dicatat dan dicocokkan dengan tabel MPN. Misalnya:
Dari 5 tabung
yang positif tes perkiraan, 4 positif tes penegasan
Dari 4 tabung
yang positif tes perkiraan, 2 positif tes penegasan
Dari 1 tabung
yang positif tes perkiraan, 0 positif tes penegasan
Maka angka 4.2.0
yang dicatat dan dicocokkan pada tabel MPN untuk mendapatkan nilai MPN-nya.Pada
tabel dengan 15 tabung, 4.2.0 memberikan nilai MPN 22 /100 ml air.
Ø 3. Tes lengkap (Completed test)
Disini digunakan
media agar EMB (Eosin Methylen Blue) atau Endo agar.Semua tabung yang
menunjukkan hasil positif pada BGLB diinokulasikan pada EMB Agar, dieramkan
pada suhu 37oC selama 2 X 24 jam. Koloni khas pada EMB Agar yaitu
warna hijau metalik dilanjutkan kepada tes IMViC untuk membuktikan apakah
spesies Escherichi coli atau bukan.Pada pemeriksaan kualitas air
digunakan berbagai macam ragam tabung yang berisi kaldu laktosa, tergantung
dari tingkat kerapatan bakteri yang ada pada air tersebut. Untuk air yang sudah
diolah digunakan ragam 5.1.1, untuk air yang belum diolah digunakan 5.5.5,
untuk air badan air dan air limbah juga digunakan 5.5.5 tetapi sebelumnya
contoh air diencerkan terlebih dahulu untuk mendapatkan hasil yang lebih akurat
(Depkes, 1993).
Tabel 2.1 Tabel MPN atau Tabel Hopkins (Depkes RI,
1993).
|
Volume
|
Nilai MPN/100
ml
|
Volume
|
Nilai MPN/100
ml
|
|||||
|
10 ml
|
1 ml
|
0,1 ml
|
10 ml
|
1 ml
|
0,1 ml
|
|||
|
0
0
0
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
|
0
0
1
2
0
0
1
1
2
0
0
1
1
2
3
0
0
1
1
2
2
0
0
1
1
1
2
|
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
1
0
0
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
2
0
|
<2
2
2
4
2
4
4
6
6
5
7
7
9
9
12
8
11
11
14
14
17
13
17
17
21
26
22
|
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
|
2
3
3
4
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
|
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
5
|
26
27
33
34
23
31
43
33
46
63
49
70
94
79
110
140
180
130
170
220
280
350
240
350
540
920
1600
>2400
|
|
Bahan
penelitian yang digunakan adalah:
1. Air yang
mempunyai nilai MPN Coliform
2. Media;(Laktosa Broth (LB) dan Brilliant
Green Laktosa Broth (BGLB))
3. Bahan lain:(Alkohol 70%. Dan Spiritus dan Aquadest).
Untuk sampel
air sumur gali (air bersih) digunakan ragam: 5 .5.5
1.Tes
perkiraan (presumptive test)
Siapkan
tabung-tabung media laktosa yang diperlukan dalam tes perkiraan yaitu:
5 tabung
yang berisi 5 ml media LB dengan kepekatan 3x (triple)
5 tabung
yang berisi 10 ml media LB dengan kepekatan 1x (single)
5 tabung
yang berisi 10 ml media LB dengan kepekatan 1x (single)
Dengan pipet
steril, dimasukkan sampel air secara aseptis kedalam tabung-tabung dengan
volume sebagai berikut:
5 tabung
deret pertama diisi masing-masing dengan 10 ml sampel air
5 tabung
deretan kedua diisi masing-masing dengan 1 ml sampel air
5 tabung
deret ketiga diisi masing-masing dengan 0,1 ml sampel air Kocok dengan
hati-hati sampai tercampur dengan baik, masukkan dalam inkubator 37oC
lalu eramkan selama 24 – 48 jam, amati pertumbuhan dan pembentukan gas setiap
24 jam, semua tabung yang menunjukkan peragian laktosa positif dalam waktu 24 –
48 jam dinyatakan sebagai tes perkiraan positif dan dilanjutkan tes penegasan,
bila dalam waktu 2 x 24 jam tidak terbentuk gas, tes perkiraan dinyatakan
negatif, dan tidak dilanjutkan ke tes penegasan.
2.Tes
penegasan (confermed test).
Tabung LB positif diinokulasikan ke tabung BGLB, kemudian
dimasukkan dalam inkubator 37oC lalu eramkan selama 24 – 48 jam,
diamati pertumbuhan dan pembentukan gas setiap 24 jam, dicatat ragam tabung
yang menunjukkan hasil positif pada tes penegasan dan cocokkan dengan tabel
untuk mendapatkan nilai MPN Coliform dari sampel air.
Pewarnaan
Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan
bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan
suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer,
maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi
bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass
tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).
Pewarnaan
Bakteri
Gelas objek dan
gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades
steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel
sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah
jadi ditetesi gram A selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan
dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B selama 1 menit, dicuci dengan air
mengalir, dan dikeringanginkan.Kemudian ditetesi gram D selama 30 detik, dicuci
dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan mikroskop dengan
perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri
Untuk
Pewarnaan Gram:1 Larutan kristal violet:Zat warna 1,Larutan Lugol:mordan,Alkohol
90-95 %:larutan pemucat,Larutan safranin:zat warna II,Alkohol 70 % dan
kapas,NaCl fisiologis,Mikroskop, Pembakar spirtus,Ose,dan Objek glass.
Ø buatlah sediaan
oles bakteri
Ø tuang pada
sediaan tersebut zat warna kristal violet, biarkan 1 menit
Ø zat warna dibuang
lalu cuci dengan air mengalir
Ø beri larutan
lugol, biarkan 1 menit
Ø lugol dibuang
dan sediaan dicuci dengan air selanjutnya dicuci dengan alkohol 96% sampai tak
ada lagi zat warna yang terlarut
Ø cuci dengan air
sampai bersih
Ø tuangkan
larutan safranin dan biarkan 1 menit, lalu cuci dengan air bersih
Ø keringkan
dengan kertas saring
Ø periksa di
bawah mikroskop dengan pembesaran 1000x )pakai minyak imersi)
-pewarnaan gram
Proses pewarnaan diferensial ini
memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan
pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.Perbedaan
ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut
warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen
kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna
dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat
mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding
sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir
adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan
terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.Bakteri hidup sulit
untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak
tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara
keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan
terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai
adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat
dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).Sel-sel mikroorganisme yang tidak
diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan
mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai
indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat
cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara
mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990). Pada
umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan
adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus
diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci
tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif
dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer,
1998).Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan
perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa
pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat.Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel
bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri.Zat warna dapat
mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatka.Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa.Pada
zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor
dan mempunyai muatan positif.Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan
memberikan zat warna memiliki muatan negatif.Zat warna basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel.
Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin,
Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin,
Congo Red dll (Irawan, 2008).Banyak senyawa organik berwarna (zat warna)
digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah
dikembangkan prosedur pewarnaan.
Tujuan
dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985)
:1.Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun
fungi.2.Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.3.Melihat struktur luar dan kalau
memungkinkan juga struktur dalam jasad.4.Melihat reaksi jasad terhadap pewarna
yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat
diketahui.Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan
dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan
menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri
terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan
mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri
pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).
Pewarnaan Negatif. Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa.Tapi
mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel
melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan
latar belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005).Setelah dilihat di mikroskop,
maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk sel
bakteri (Anonim, 2008):
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif)
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di
atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri
yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan
diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan
untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass
tanpa merusak struktur selnya.
Cara Kerja :
· Bersihkan object glass dengan kapas
· Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada
sudut object glass
· Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes
biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum.
Jangan lupa biakan dikocok terlebih dahulu.Jika digunakan biakan padat, maka
biakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi
akuades dan disebarkan supaya sel merata.
· Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya
dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali)
· Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya
ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue, Safranin,
CrystalViolet) dan tunggu kurang lebih 30 detik.
· Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas
tissue
· Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).
Bakteri tahan asam adalah bakteri yang pada pengecatan
Ziehl-Neelsen (ZN) tetap mengikat warna pertama, tidak luntur oleh asam dan
alkohol, sehingga tidak mampu mengikat warna kedua.Bakteri tersebut ketika
diamati dibawah mikroskop tampak berwarna merah dengan warna dasar biru muda.
Terdapat lebih dari 50 spesies Mycobacterium, antara lain banyak yang merupakan
saprofit.Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri tahan asam, berbentuk
batang dan bersifat aerob obligat yang tumbuh lambat dengan waktu generasi 12
jam atau lebih. Mycobacterium tuberculosis menyebabkan tuberculosis dan
merupakan patogen yang berbahaya bagi manusia.Mycobacterium leprae menyebabkan
lepra. Mycobacterium avium-intracellulare (kompleks M. avian) dan mikobakteria
apitik lain yang sering menginfeksi pasien AIDS, adalah patogen ortunistik pada
orang-orang dengan fungsi imun yang terganggu lainnya, dan kadang-kadang
menyebabkan penyakit pada pasien dengan sistem imun yang normal.Sumber
penularan adalah penderita TB yang dahaknya mengandung kuman TB hidup (BTA
positif). Infeksi kuman ini paling sering disebarkan melalui udara (air borne,
droplets infection).Penyebaran melalui udara berupa partikel-partikel percikan
dahak yang mengandung kuman berasal dari penderita saat batuk, bersin, tertawa,
bernyanyi atau bicara. Partikel mengandung kuman ini (berukuran diameter 1-5
µm) akan terhisap oleh orang sehat dan menimbulkan infeksi di saluran napas.
Terdapat beberapa macam bahan spesimen dalam pemeriksaan laboratorium tuberkulosis yaitu:
Sputum (dahak), harus benar-benar dahak bukan ingus juga bukan ludah.Ø
Air kemih pagi hari, pertama kali keluar merupakan urin pancaran tengah.Ø
Air kuras lambung, umumnya anak-anak atau penderita yang tidak dapat mengeluarkan dahak.Ø
Bahan-bahan lain, misalnya nanah, cairan cerebrospinal, cairan pleura, dan usapan tenggorokan.ØPewarnaan kuman BTA dapat dilakukan dengan 3 macam pewarnaan yaitu Ziehl-Neelsen, Tan Thiam Hok (Kinyoun-Gabbett) dan Auramin–phenol fluorochrome.Umumnya pewarnaan Ziehl-Neelsen dan Tan Thiam Hok yang sering digunakan. Hasil yang didapat disamakan dengan penilaian IUATLD (International Union Against Tuberculose Lung Diseases)
Terdapat beberapa macam bahan spesimen dalam pemeriksaan laboratorium tuberkulosis yaitu:
Sputum (dahak), harus benar-benar dahak bukan ingus juga bukan ludah.Ø
Air kemih pagi hari, pertama kali keluar merupakan urin pancaran tengah.Ø
Air kuras lambung, umumnya anak-anak atau penderita yang tidak dapat mengeluarkan dahak.Ø
Bahan-bahan lain, misalnya nanah, cairan cerebrospinal, cairan pleura, dan usapan tenggorokan.ØPewarnaan kuman BTA dapat dilakukan dengan 3 macam pewarnaan yaitu Ziehl-Neelsen, Tan Thiam Hok (Kinyoun-Gabbett) dan Auramin–phenol fluorochrome.Umumnya pewarnaan Ziehl-Neelsen dan Tan Thiam Hok yang sering digunakan. Hasil yang didapat disamakan dengan penilaian IUATLD (International Union Against Tuberculose Lung Diseases)
Pembuatan
Sediaan Apus Sputum
1.
Ose dipanaskan di
atas api spirtus sampai merah dan didinginkan.
2.
Sputum disiapkan
(hati-hati, hindari droplet/percikan sputum), diambil sedikit dari bagian yang
kental dan berwarna kuning kehijauan (purulen) menggunakan ose.
3.
Sputum dioleskan
secara merata (seperti obat nyamuk) pada objek glass (dengan ukuran 2×3 cm).
4.
Ose yang telah
digunakan dimasukkan ke dalam alkohol sambil digoyang-goyangkan sampai
sisa-sisa sputum bersih, kemudian dibakar.
<>mikroskop
dengan pembesaran 100 kali.2. Dicari dengan adanya batang panjang atau pendek yang berwarna merah dengan latar belakang berwarna biru.
Penilaian
1. BTA negatif : apabila dalam 100 LP atau 15 menit pengamatan tidak dijumpai adanya BTA.
2. BTA positif : apabila dalam pengamatan dijumpai adanya BTA. BTA posiif apabila dibuat sediaan langsung dan diwarnai dengan Ziehl-Neelsen atau Kinyoun Gabbert maka dapat dilakukan penilaian sebagai berikut :
Penilaian menurut IUATLD (International Union Against Tuberculose Lung Diseases)
Negatif : Tidak dijumpai adanya BTA.Ø
Positif : Ditemukan 1-9 BTA/100 LP.Ø
Positif 1 : Ditemukan 10-90 BTA/100 LP.Ø
Positif 2 : Ditemukan 1-10 BTA/1 LP.Ø
Positif 3 : Ditemukan lebih dari 10 BTA/1 LP.Ø
Pewarnaan Ziehl Neelsen menurut Kurniawati 2005,
larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian
dipanaskan di atas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih
atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit
lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir
perlahan.Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang
pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama
1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang
sampai menutupi seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan
dicuci dengan air mengalir.Pewarnaan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri
tahan asam yang berwarna merah dengan latar berwarna biru. Bakteri tahan asam
akan mempertahankan warna pertama yang diberikan. Hasil yang didapat adalah
terdapatnya bakteri tahan asam.Mycobacterium tuberculosis, pertama kali
ditemukan oleh Robert Koch tahun 1882, termasuk Ordo Actinomycetales Familia
Mycobacteriaceae, Genus Mycobacterium dan mempunyai banyak spesies.Penyakit
yang ditularkan oleh basil tersebut dikenal dengan sebutan TBC atau Tb-paru.Kuman
TBC masuk ke paru-paru melalui pernafasan (aerosol) (Girsang,
2002).Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies-spesies tertentu
dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoid (berlemak) di dalam
dinding-dinding selnya.Hal ini mengakibatkan dinding sel tersebut relatif tidak
permeable terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel-sel bakteri tersebut
tidak terwarnai oleh metode-metode pewarna biasa.Kedua genus tersebut
mengandung spesies-spesies yang patogenik bagi manusia.Bakteri yang paling
dikenal diantaranya adalah M. tuberculosis, penyebab penyakit tuberculosis dan
M. leprae penyebab penyakit lepra. Menunjang diagnosis penyakit-penyakit
tersebut, bakteri penyebabnya harus dapat diisolasi dari spesimen si sakit dan
dibuat tampak serta mudah dibedakan dengan bakteri-bakteri yang lain. Akibat
sifat dinding selnya yang demikian itu maka untuk memenuhi tujuan tersebut
harus digunakan pewarna khusus (Hadioetomo, 1993).Teknik pewarnaan khusus itu
disebut juga pewarnaan tahan asam, mula-mula dikembangkan oleh Paul Ehrlich
pada tahun 1882 ketika meneliti M.tuberculosis.Prosedur pewarnaan yang umum
digunakan pada masa kini merupakan hasil perbaikan teknik Ehrlich yang asli,
yaitu pewarna Ziehl-Neelsen, dinamakan menurut kedua orang peneliti yang
mengembangkannya pada akhir 1800-an. Prosedur ini menggunakan pewarna utama
dengan pemanasan, dan biru metilena Loeffler sebagai pewarna tandingan.
Modifikasi teknik ini yang berkembang kemudian, perlakuan panas diganti dengan
penggunaan pembasah (suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak)
untuk menjamin penetrasi, pewarna yang mengandung bahan pembasah ini disebut
pewarna Kinyoun Pewarnaan Ziehl Neelsen menurut Kurniawati 2005, larutan carbol
fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan di
atas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering
selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu
kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan.Setelah
itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan
dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit,
kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutupi
seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air
mengalir.Pewarnaan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang
berwarna merah dengan latar berwarna biru. Bakteri tahan asam akan
mempertahankan warna pertama yang diberikan. Hasil yang didapat adalah
terdapatnya bakteri tahan asam.
Teknik Membuat sediaan untuk
pemeriksaan mikroskopik
Pada
pemeriksaan langsung , bakteri diperiksa dalam keadaan hidup. Kelebihan cara
ini adalah cepat, mudah, dan murah namun harus diperiksa segera dan tidak dapat
dibiarkan lama karena preparat akan cepat kering. Sediaan basah dilakukan dari
bahan pemeriksaan langsung, menggunakan KOH untuk jamur dan NaCl untuk melihat
bakteri dalam keadaan hidup. Cara ini juga dipakai untuk memeriksa gerak kuman
secara mikroskopik. Ada dua cara pemeriksaan mikroskopik yang biasa dilakukan,
yaitu :
Caranya :
Ø ambil 1 ose
biakan cair atau dari dari koloni yang disuspensikan pada larutan NaCl
fisiologis, lalu oleskan di atas gelas objek
Ø tutuplah biakan
tersebut dengan gelas penutup yang telah diolesi vaselin pada bagian tepinya
Ø segera periksa
di bawah mikroskop dengan pembesaran 400x.
Prinsip : Pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur
dinding sel bakteri, sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas
zat warna dan penambahan larutan pencuci. Dinding sel bakteri Gram positif
terdiri dari lapisan peptidoglikan yang tebal sedangkan dinding sel bakteri
Gram negatif mempunyai kandungan lipid yang tebal. Ketika ditambahkan pewarnaan
kristal violet maka dinding sel bakteri Gram positif maupun Gram negatif akan
menyerap zat warna tersebut namun ketika diberi alkohol, kristal violet pada
Gram negatif akan luntur disebabkan struktur dinding selnya yang sebagian besar
tersususun oleh lipid, sehingga ketika diberi safranin (zat warna kedua)
dinding sel bakteri gram negarif akan menyerapnya kembali sehingga hasil
pewarnaan bakteri Gram negatif akan berwarna merah, sedangkan bakteri gram
positif akan tetap berwarna ungu walaupun diberi zat warna kedua, karena
dinding selnya tersusun oleh lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga tidak
dapat dicuci oleh alkohol. Hal ini memberi hasil pewarnaan ungu pada bakteri
Gram positif.
B.
Tujuan
1.Untuk mengetahui teknik pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA).
2.Mengetahui tingkat infeksi dari sputum.
1.Untuk mengetahui teknik pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA).
2.Mengetahui tingkat infeksi dari sputum.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar